rimer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分：targettemplate（模板区）,theprimers（引物区）,和specificitycheck（特异性验证区）。跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advancedparameters”有的参
这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的 Blast进行引物特异性的验证。那该怎么使用呢？一起来看看吧！
材料/工具
计算机
方法
Primer-BLAST的输入：Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。
不就是说你的上游引物没法在你所输入的序列上发现，你确认下序列号和引物序列都对不对。
模板（Template） 在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。
如何利用NCBI中的Primer-BLAST设计引物 首页 问题 全部问题 经济金融 企业我们会通过消息、邮箱等方式尽快将举报结果通知您。 说明 0/200 提交 取消 新手
引物（Primers） 如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在specificity check区选择）。根据需要可设置产物的大小，Tm值等。
organism这项觉得可以默认不填，因为你要搜索的物种表达方式可能会有好几种。不填的话搜索的范围会更全，更能检测你的产物特异性。
特异性（Specificity） 在specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了4种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库
你的意思是引物特异性不好，会将同源基因克隆出来？ 如果这样的话可以适当的增加引物bp数，或者是让引物跨编码区与非编码区，还有就算特异性不好还可以在克隆的时候降低退火温度来调节。
作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种： human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。
数据库构建基于ncbi收录的所有核酸序列对你提交的序列或者引物进行比对，设计的引物可以跨内含子，外显子等等等。不错的。 misprimed product没看到过，不知道
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NCBi primer-blaet 引物设计输入DNA templete时如何区分内含子和外显子
这个软件有明确说明：“A refseq mRNA sequence (for example an entrez sequence record that has accession starting with NM_) allows the program to properly identify the corrsponding genomic DNA and thus find correct exon/intron boundaries.”
你不需要输入内含子，但是在输入序列的时候必须是NM_打头的记录，这样软件自动会根据基因组的序列找到内含子和外显子的交接区
如何将ncbi的dna数据导入primer5.0
首先打开NCBI，将查找范围选定为Nucleotide，输入关键词，找到目的序列
首先肯定是要有保存好的基因序列，这里我是从NCBI上保存的DNA序列
然后，打开Primer应用程序，单击Activate Product进行激活。打开新的GenTank核酸窗口
打开保存的DNA序列
点击Primer，查找引物
然后点击Search，参考参数寻找合适的引物
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